DNA Sequencing ฉบับคนทั่วไป (อยู่) ตอน 2 : Sanger Sequencing

จากตอนที่แล้วเราปูพื้นฐานพวกเรื่องโครงสร้าง DNA ไปแล้ว อาจจะมองว่า แล้วมันเกี่ยวอะไรกับ DNA Sequencing ตอนนี้แหละ เราจะได้รู้กัน ถ้าใครที่ไม่เคยทราบเรื่องโครงสร้างมาก่อน เราอยากให้กลับไปอ่านตอนแรกก่อนนะ โอเค ในตอนนี้เราจะพามารู้จัก การทำ DNA Sequencing ในยุคแรก ๆ กัน ว่า เขาทำอย่างไร

ความพยายามหลังแบบจำลอง DNA

หลังจากที่ Watson และ Crick เสนอแบบจำลองของ DNA ในปี 1953 ตอนนั้นก็มีความพยายามหลายการทดลองมาก ๆ ในการที่จะหาลำดับของ DNA ออกมาให้ได้ เช่น ในปี 1695 Robert Holley ได้ทำการถอดลำดับของ tRNA เป็นครั้งแรก และ ได้รับรางวัลโนเบลในปี 1986

Sanger Sequencing

หนึ่งในความพยายามระหว่างนั้นคือ Fredrick Snager ก็พยายามจะหาวิธีในการถอดรหัส DNA และในปี 1977 วิธีแรกสุดในการถอดรหัส DNA ก็ได้ถูกสร้างขึ้นมา วิธีนี้เราเรียกว่า Chain Termination Method หรือเราเรียกว่า Sanger Sequencing ซึ่งเป็นการค้นพบที่สำคัญมาก ๆ มันเป็นเหมือนกับการ ปฏิวัติวงการทางพันธุกรรมเลยก็ว่าได้ ซึ่งแน่นอนว่า ได้โนเบลในปี 1980 ด้วย ซึ่ง DNA ที่ได้รับการถอดรหัสเป็นครั้งแรกโดยการใช้ Sanger Sequencing คือ Genome ของ PhiX174 เป็นพวก Bacteriophage หรือก็คือ Virus ที่ไปทำให้ E.Coli ติดเชื้อได้

งั้นเรามาดูหลักการกันดีกว่าว่าเขาทำอย่างไร เทคโนโลยีส่วนใหญ่ที่เราอาจจะได้เห็นกัน จะใช้เทคโนโลยี หรือวิธีการอย่างการทำ PCR (Polymerase Chain Reaction) เช่นพวกการตรวจ COVID-19 เราก็ใช้ RT-PCR ในการตรวจกัน

ณ ตอนนั้นเรารู้จักการทำ Gel Electrophoresis และการทำ PCR ทั้งหลาย ถามว่าถ้าเราต้องการลำดับของ DNA เราจะทำอย่างไรได้บ้าง เรารู้ว่า การทำ Gel Electrophoresis พอเราอัดไฟฟ้าเข้าไปชิ้นส่วนของ DNA ที่เล็กจะวิ่งเร็วไปไกล และอันที่ใหญ่จะวิ่งไปได้ช้ากว่า เอ๊ะ ถ้าเราตัด หรือเอาชิ้นส่วนของ DNA มาหั่น ๆ และเอามารัน Gel Electrophoresis เราก็น่าจะได้ชิ้นหลาย ๆ ขนาดออกมาจาก DNA ตัวเดียวกัน

สำหรับในการทำ Sanger Sequencing เราทำแบบนี้ โดยการทำ PCR ซึ่งส่วนประกอบในการทำ PCR คือ มีตัวอย่างของเรา, DNA Polymerase, Primer และกลุ่มของ Nucleotides คือพวก dNTP แต่ มันเป็น PCR พิเศษหน่อย คือพวก Nucleotides ปกติ พอเราต่อเข้าไปมันก็จะสามารถต่อไปเรื่อย ๆ จนจบได้ แต่เราอยากให้ให้มีการ Block ด้วยเพื่อทำให้มันไม่สามารถต่อได้แล้ว เราเลยเรียกวิธีนี้ว่า Chain Termination ผ่านการใส่ Dideoxyribonucleic Acid Nucleotides (ddNTPs) เพิ่มเข้าไป ซึ่ง N ใน ddNTP มันก็จะแทนเบส A,T,C และ G ทำให้เป็น ddATP, ddTTP, ddCTP และ ddGTP ถามว่าต่างกันอย่างไรกับ DNA ปกติก็คือ มันจะไม่มีหมู่ Hydroxyl บริเวณขา Carbon ที่ 3

ทำให้เมื่อเกิดการ Replication ผ่าน PCR ที่เราคุยกัน และ ddNTP จับเข้าไป ทำให้การ Replication บนเส้นนั้นมันหยุด แต่ถ้าผสม dNTP ปกติ มันก็จะไปต่อได้ บางเส้นไปต่อได้ บางเส้นไปต่อไม่ได้ สุดท้าย เมื่อเราเอามาเรียง ๆ กันตามขนาด เราก็จะได้เหมือนรูปด้านบนนั่นเอง

เมื่อเรารู้ลำดับได้ละ แต่ถามว่า เราจะรู้ได้อย่างไรว่า ลำดับมันหน้าตาเป็นอย่างไร เราจะรู้ได้ยังไง ว่ามันเป็นเบสอะไร A,T,C หรือ G เพื่อให้เรารู้ได้ งั้นเราเติมอะไรบางอย่างลงไป กันดีกว่า นั่นคือพวกสารเรืองแสงต่าง ๆ เพื่อให้เราดูได้ว่ามันคือเบสตัวไหน

ทำให้เมื่อเรา PCR โดยใช้วิธีการที่เราเล่าไป และ เราเอาไปรัน Gel Electrophoresis แล้วถ่ายออกมา เราก็จะเห็นจากผลรัน Gel เลย เราก็แค่อ่านไปเรื่อย ๆ เราก็จะได้ลำดับของ DNA ออกมานั่นเอง

แต่การทำแบบนี้ โหยยย มันแอบยากมากนะ จะ Sequencing อะไรใหญ่ ๆ มันก็ยุ่งสิทำแบบนี้ เพื่อความง่ายมันก็จะมีพวกระบบอัตโนมัติขึ้นมา เวลาเราทำ เราจะโหลด ddNTP ทุกตัวเข้าไปในรวดเดียวเลย เราก็จะได้ออกมาเส้นเดียว แล้วเราก็อ่านเรียงไปเลยก็จบ ง่ายกว่ากันเยอะ

วิธีอื่น ๆ ในยุคนั้น

อีกวิธีที่เกิดขึ้นและเป็นที่รู้จัก ก็น่าจะเป็น Maxam–Gilbert sequencing ที่ใช้พวกสารกัมมันตรังสี แทนที่จะใช้พวกกลุ่มที่ทำ PCR เหมือนของ Sanger แต่ด้วยวิธีการนี้ มันต้องทำงานกับพวกสารกัมมันตรังสี เลยทำให้มันไม่ได้เป็นที่นิยมในตอนนั้นเหมือนกับพวก Sanger Sequencing เราขอไม่เล่าละกันว่า มันทำยังไง เพราะส่วนใหญ่ เราก็ไม่ได้ทำกันแล้ว แต่สำหรับ Sanger Sequencing จนถึงทุกวันนี้ มันเป็นเหมือน Gold Standard ในการ Sequence เพื่อเช็คความถูกต้องของวิธีในยุคต่อไปที่เราจะเล่าในตอนหน้า

ทำไมวิธีพวกนี้ถึงไม่ตอบโจทย์

จริง ๆ วิธีการอย่าง Sanger Sequencing หรือ Chain Termination Sequencing เอง มันแอบทำได้ยาก เสียเวลา และ ทำให้เป็นอัตโนมัติทั้งหมดเป็นไปได้ยากมาก ๆ นั่นแปลว่า ถ้าเราต้องการที่จะ Sequence Genome ขนาดใหญ่ เป็นเรื่องที่ยาก และ ใช้เม็ดเงินสูงมาก ๆ

ดูจากตัวอย่างที่เราเล่าไป ในตอนนั้น เราก็ Sequence Genome ของพวก Bacteriophage เท่านั้นเอง ไม่ได้มี Genome ใหญ่เลย แล้วถ้าเราอยากจะ Sequence Genome ขนาดใหญ่ ๆ อย่าง ของคนเอง หรือพืชบางชนิดเอง เราจะทำอย่างไรดีละ นอกจากลงแรง และ เงินเยอะมาก ๆ เข้าไป

ดังนั้นในตอนหน้า เราจะมาก้าวสู่ยุคใหม่กันว่า มันจะมีวิธีการอะไรบ้างที่จะทำให้เราสามารถ Sequence Genome ขนาดใหญ่ ๆ หรือ ต้องการความละเอียดสูง ๆ เราจะมีวิธีไหนบ้าง